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Link 20-A re-examination of Raper's scheme : Cyclodopa as precursor of eumelanin ( Italian and English text )

Cyst einyldopa

Cyclodopa

The black pigment of guinea-pig fur is due to eumelanin formed by enzymatic or non enzymatic oxidation of Cyclodopa, whereas the red fur is due to pheomelanin, formed by enzymatic or non enzymatic oxidation of cysteinyldopa yielding the 5-oxy-7-alanyl-benzothiazinone, the true precursor of pheomelanin and pheochromes Link 14.

In 1895 Bourquelot and Bertrand observed that the toadstool Russula nigricans contains a colourless substance which blackens by exposition to air.In 1896 Bertrand recognized the substance as tyrosine. When tyrosine was allowed to oxidise in the presence of a mushroom extract a black precipitate was formed.. This polyphenoloxidase was given the name of tyrosinase .

This enzyme was subsequently found in extracts from many other plants and from the tissues of various invertebrates and vertebrates, including mammals.Although some properties of the black precipitate resulting from the action of tyrosinase on tyrosine were not in agreement with the properties of natural pigments ( hair, eye, melanomas, sepia ink), nevertheless it was believed that natural pigments are produced by the tyrosine/tyrosinase reaction.

Tyrosinases were found to be essential for the initial conversion of tyrosine to dopa , whereas the subsequent steps proceed spontaneously without any specific enzymatic assistance.

Small amounts of two products, that is the 5,6-dihydroxyindole (DHI) and a related compound the 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA), were identified by stopping the oxidation of tyrosine (dopachrome stage ) and allowing the red solution to decolorize under aneorobic conditions and in an SO2 atmosphere The indoles were recovered as dimethyl ethers.

The most important studies on melanogenesis were started by H.S.Raper in the period 1920-1935 ( Raper was Professor of Physiology and collegue of Sir Robert Robinson at the Manchester University )

L.Linnel, H.S.Raper (1935) Biochem. J. 29, 75-85 ; R.D. Hoskin-Heard,H.S.Raper, (1933) Biochem. J. 27, 36 - 53; W.L. Duliere, H. S. Raper (1930) Biochem . J. 24 , 239- 249 ; H. S. Raper (1928) , Physiol. Rev. 8 , 245- 282 ; H. S. Raper , (1927) Biochem. J. 21 , 89- 95 ; H. S. Raper (1926) Biochem. J. 20, 735- 745 ; H. S: Raper , A. Wormall (1925) 19, 84- 91 .

All the papers cited were made with funds of Government Grant Committee of the Royal Society

The most relevant part of Raper's work has been reported in the elegant review : A.Quilico, I pigmenti neri animali e vegetali , Ed. FUSI, Pavia 1937. Here a text (pag.154-160) is reported.

All'inizio della sue ricerche , Raper ebbe ad osservare quale notevole influenza avesse sull' andamento della reazione il pH del mezzo in cui I'enzima agisce, dal quale dipende non solo la velocita con cui appare la colorazione, ma anche I' aspetto e Ia natura dei prodotti che si ottengono. A questo proposito, dobbiamo ricordare anche i risultati di H. Pribram e collaboratori ,secondo i quali appare possibile di influire sul colore ottenibile con una data tirosinasi; nelle prove eseguite su crisalidi di lepidottero, si è potuto, mediante una cauta attenuazione dell ' enzima per riscaldamento, trasformare una tirosinasi capace di colorare in violetto, in una colorante in rosa. Questo può anche dare una spiegazione della grande varietà di aspetto delle melanine naturali; è probabile ad es. che la colorazione rossa dei capelli umani o dei crini dei cavalli a mantello fulvo sia da attribuire ad un arresto o ad una deviazione dal solito modo di formazione delle melanine, e non è da escludere che il verde che domina in alcune classi di insetti (come gli ortotteri) si possa originare in modo analogo.

I risultati ottenuti dai precedenti A A. nello studio della reazione tirosina-tirosinasi, ottenuti senza garantirsi con I' aggiunta di opportuni tamponi, contro le variazioni del pH, sono quindi da ritenere malsicuri. Variando le condizioni di pH, e con I' impiego di un adatto materiale enzimatico, Raper e Wormall hanno potuto riconoscere che I' azione della tirosinasi sulla tirosina si compie in tre fasi distinte:

Il primo di questi passaggi, è un processo enzimatico, dovuto all' azione specifica del fermento, ed avviene solamente in presenza dell' ossigeno molecolare, atmosferico. Il secondo, è verosimilmente una trasposizione molecolare che ha luogo spontaneamente, rapidamente per riscaldamento, ed indipendentemente dalla presenza o meno dell' enzima. Il terzo passaggio, sembra essere una ossidazione e condensazione puramente chimica, che si realizza anch' essa in assenza dell' enzima, richiede la presenza dell' ossigeno atmosferico, e la cui velocità appare essere notevolmente influenzata dalla reazione del mezzo, avvenendo rapidamente in soluzione alcalina, piu lentamente in ambiente acido. I limiti azione della tirosinasi di patata giacciono intorno a 5 e 10 I' optimum, determinato per via colorimetrica dalla intensità di colorazione dei liquidi, si trova tra 6 e 8. L' influenza del pH si fa sentire in modo differente sulle tre fasi della reazione; cosi a pH= 6 si hanno le condizioni migliori per la formazione della sostanza rossa, mentre che a pH=8 si hanno le condizioni piu adatte per il suo passaggio al corpo incoloro. Di questa circostanza si approfitta per arrestare la reazione all' ottenimento del prodotto desiderato; cosi ad es., nel caso in cui si impieghi la tirosinasi di Tenebrio, per procurarsi la sostanza rossa, basta, dopo di aver fatto agire per un tempo sufficiente I' enzima ad un pH=6, rendere nettamente acido il liquido oppure, come ha fatto Raper per la tirosinasi di patata, si puo allontanare dal liquido I enzima che ha agito. facendola adsorbire da idrato ferrico colloidale. La soluzione rossa, formatasi per azione della tirosinasi, quando venga conservata nel vuoto, o portata all' ebollizione, o più rapidamente ancora, abbandonandola atemperatura ambiente in presenza di SO2, si decolora e da essa è possibile isolare una sostanza incolora che cristallizza dall' acqua in aghi o prismi p. f. 279° con decomposizione, che è risultata identica alla diossifenilalanina naturale, levogira, che si può estrarre dalla Vicia faba. La resa, operando almeno in queste condizioni, non supera pero il 3% sulla tirosina impiegata. Alla sostanza rossa, il Raper aveva attribuito, almeno in un primo tempo , la struttura indicata a lato , la quale come diremo, è stata in seguito da lui modificata. La diossifenilalanina si puo isolare piu convenientemente sotto forma di sale di piombo, precipitando la soluzione acida con acetato di Pb. Data la grande ossidabilita dei prodotti che si formano per decolorazione della sostanza rossa, Raper è ricorso all' artificio di renderli stabili mediante metilazione dei gruppi ossidrilici fenolici presenti.

La soluzione rossa ottenuta per azione della tirosinasi di Tenebrio su una soluzione di tirosina,viene decolorata per azione del calore e della SO2 , concentrata in atmosfera di CO2 , alcalinizzata e sottoposta a metilazione con solfato di metile in ambiente di idrogeno. In questo modo è possibile di isolare altri due prodotti, uno dei quali ha carattere debolmente basico, I' altro è invece nettamente acido. La prima di queste sostanze è il 5,6 dimetossiindolo p.f. 154°-155°, la seconda I'acido 5,6 dimetossindolcarbonico; questo dimostra che nella reazione tirosinasi- tirosina, oltre alla diossifenilanina, si formano anche il 5,6 diossindolo e I'acido 5,6 diossindolcarbonico. Le quantità relative di questi prodotti dipendono dal modo in cui si esegue la decolorazione del prodotto rosso primario.

Se questa viene realizzata per ebollizione prolungata, senza I' intervento di SO2 , si ottiene in prevalenza il diossiindolo. se invece si opera a freddo, con SO2 , si ha maggiore quantita del secondo. Questo rende assai probabile che il diossindolo non rappresenti che un prodotto secondario di decarbossilazione delI' acido diossindolcarbonico.

In quanto alla diossifenilalanina, essa rappresenta un prodotto primario della reazione, che non è in immediata relazione con la sostanza rossa come i due derivati indolici sopra descritti.La struttura di queste sostanze è stata dimostrata rigorosamente dalla sintesi fatta da Oxford e Raper .

Circa la struttura del prodotto rosso primario ( dopacromo n.d.r.) il quale si forma anche per azione della tirosinasi sulla DOPA è molto verosimile si tratti dell'ortochinone corrispondente all'acido diossidrindolcarbonico.

In base a questi risultati Raper ha potuto dare uno schema del processo secondo il quale queste sostanze che sono i precursori della melanina si formano a partira dalla tirosina.

Come da esso si vede il primo passo della azione della tirosinasi consiste nella introduzione di un nuovo ossidrile fenolico in orto rispetto a quello gia esistente nella tirosina con formazione di diossifenilalanina;ha luogo poi una deidrogenazione a dopachinone il quale per trasposizione molecolare si trasforma per chiusura dell'anello in acido diossiidrindolcarbonico.Questo per una nuova deidrogenazione dà origine alla sostanza rossa ( chinone dell'acido diossiidrindolcarbonico ) che per una nuova trasposizione passa all'acido diossiindolcarbonico DHICA (n.d.r.) incolore dal quale per eliminazione di CO2 si arriva finalmente al 5,6 diossindolo DHI (n.d.r ).

Come si è accennatodi questi corpi sono stati isolati DOPA, DHI, DHICA gli altri sono ipotetici Le ultime due sostanze rappresentano gli ultimi precursori di nota costituzionedelle melanine le quali si formano daessi per processi di condensazione e ossidazione ancora oscuri.

L'azione della tirosinasi sarebbe necessaria solo fino ad ottenere la sostanza rossa dopo entrerebbero in gioco fattori puramente chimici.

The synthesis of DHI and DHICA was reported in 1948. It was found that on exposure to air, especially in alkaline solution DHI rapidly undergoes oxidative polymerization to give a dark insoluble melanin, whereas under similar conditions the transformation of DHICA into melanin is much slower yielding a brown solution with no precipitation of melanin.

From these experiments it was inferred that of the two indole precursors only DHI was involved in melanogenesis. It was later confirmed that oxygen consumption and carbon dioxide evolution during the enzymatic oxidation of dopa were consistent with DHI being the major ultimate precursor of the melanin polymer.

Schweizerische Chemische Gesellschaft, Herbstversammlung in Bern ,19. Oktober 1983,

Universitaet Bern (Organische chemie ) : Sur la chimie des melanines:transformation du dopachrome en dihydroxy-5, 6- indole carboxylate -2.

DHI and DHICA are obtained artificially and are not physiological melanin intermediates.

Selon le schema de la melanogenese de Raper , le dopachrome se transforme en dihydroxy- 5, 6- indole (DHI) et dihydroxy- 5, 6- indole carboxylate- 2 (DHICA) ,composes qui par oxidation et polymerisation ,conduisent aux melanines (R.A.Nicolaus,Melanins,Hermann,Paris,1968.). Les conditions de formation et reactivitè de ces deux indoles sont pourtant toujours peu connues .

Nous avons reexamine les proprietes et la transformation du dopachrome par spectrophotometrie rapide. En solution a pH 6-7 , a temp . amb . ,le dopachrome est stable pendant quelques heures ; per contre, a temperature plus elevèe (60°) , la decomposition est complete en quelques minutes : le produit forme est le dihydroxy-5,6- indole (DHI). A pH èlevè ( 10) , on observe dèjà a temp . amb. la transformation rapide en dihydroxy -5,6- indole carboxylate- 2. (DHICA). A des pH intermediaires on obtient des mèlanges de 2 et 3 . La sèparation des deux chemins rèactionels coincide avec une ètape de dèprotonation du dopachrome (pK ca. 8 ) .Sur la base de ces observations, nous avons èlaborè des methodes simples pour la prèparation de 2 et de 3 . Ces composès,en particulier 3 et ses dèrivès mèthylès en position 5- et 6- , servent ègalement de substances de rèference en mèdecine . et ne pouvaient ètre obtenus jusqu' à prèsent que par des voies laborieuses.

Only 50% of the Dopa is converted into melanin. DHICA is an artificial product of melanogenesis.

( L.Stravs-Mombelli,H.Wyler '' Reinvestigation on the formation of Dopa-melanin: New aspects of the autoxidation of Dopa '' ) presented at the XIIIth, International Pigment Cell Conference,Giessen, De,1983.

The autoxidative formation of dopachrome and its conversion to 5, 6- dihydroxyindole-2-carboxylate (DHICA) at high pH are shown . Under the usual autoxidation conditions, at pH 8, only half of dopa is converted to melanin : a new method is applied to separate it from the rest of the products, These ,mostly monomeric carboxylic acids , are shown to derive in part from the intermediate dopachrome by oxidative cleavage of the aromatic ring . For the main product a tentative structure is proposed and its relevance in connection with the melanin structure is discussed

The reaction tyrosine-melanin occurs with formation of CO2 and H2O2 The H2O2 formation in the oxidative process of diphenols was a well known reaction in Raper's time.It was a surprise to find that the CO2 arises not only from the carboxyl of DOPA but also from the breakdown of a benzene nucleus. In the oxidation of DOPA only 50% of DOPA is transformed into melanin the rest being formed by breakdown products of the DOPA derivatives .Morever it was found that DHI is not the only melanogen but also DOPA, and Cyclodopa may produce melanin.

In auto or enzymatic DOPA oxidation, using labelled precursors, melanins composed of dopachrome , cyclodopa, uncyclised dopa units, indole units, pyrrole units were obtained.These result are in disagreement with Raper's scheme which had been proposed for the study of the natural process of melanogenesis.

In conclusion while the difference between natural and synthetic melanins was not fully appreciated tyrosinase and DHI were generally accepted as the enzyme and the authentic melanogen involved in the natural process.

The most up-dated Raper's scheme reports DHICA as an important intermediate of melanogenesis this being a process which produces both DHI and DHICA ( Prota, Pigment Cell Res.13, 283-293, 2000 ).

It is claimed that in the reaction tyrosine-----------melanin 5 atoms of oxygen are consumed,1 mole of CO2 is evolved, 1 mole of H2O2 is formed.

CO₂arises not only from the DOPA carboxyl but also from the breakdown products of the benzene nucleus .Nevertheless, it has been suggested that melanin is a polyindolequinone with the of formula C₈H₅O₂N.

Raper's scheme of melanogenesis which is considered to operate also in vivo is an arbitrary chemical representation of melanogenesis.All the compounds which are considered intermediates may give a melanin or may contribute to the melanin formation Another unexplained finding of Raper's scheme is that polymer has at least one oxygen and two hydrogen atoms more than the monomer (DHI or DHICA ).As a consequence some melanins are derived from a precursor which does not appear in Raper's scheme. In other words eumelanin has been considered until now a polymer of artefacts (DHI and DHICA). Furthermore it was found that DHI shows potent cytotoxicity ( J.M.Pawelek,A.B.Lerner,Nature,278,627,1978 )

We have recently observed, on the basis of old laboratory data, that some melanins are hydrated polyindolequinones characterized by the radical-polarone system of acetylene-black, having one oxygen atom more with respect to the precursor ( DHI-melanin, adrenalin-melanin , catechol-melanin).The oxygen was believed to be part of a H-bonded stabilized gem-diol group formed by addition of water to the quinone group. These structures are in agreement with analytical data and chemical behaviour; the gem-diol carbon atom may produce CO2 there by explaining the evolution of CO2 on heating of DHI-melanin prepared in the presence of catalase.

The study of dopa-melanin (R.A.Nicolaus, Melanins, Hermann, Paris,1968; G.Prota, Melanins and melanogenesis,AP,San Diego,1992 ),the chemical analysis of Sepia-melanin,the study of degradation products,(M.Piattelli,R.A.Nicolaus,Tetrahedron,15,6675,1961,pag.66,71;M.Piattelli,E.Fattorusso,S.Magno,R.A.Nicolaus,Tetrahedron,19,2061-2072,1963,(pag.2061,2064,2066); R.A.Nicolaus,M.Piattelli, J. Polym. Sci.,58, 1133-1139, 1962 ; always show the presence of cyclodopa or dopachrome (or its decarboxy derivatives) units in the natural polymer.

Typical are the results obtained in experiments conducted on sepiomelanin in comparison with DHI-melanin:

a. oxidation of methylated pigments shows the presence of NH3 and CH3 NH2 in the breakdown products of the natural pigment.

b. in alkali fusion methylcatechol is obtained from the sepiomelanin and not from DHI-melanin.

It is surprising that all these results were systematically ignored by chemists of Pigment Cell Society (PCS).

The paper which reports (V.J.Hearing,T.Ekel, P.M.Montague, J.M.Nicholson, BBA, 611,261-268,1980 ) the absence of dopa, dopachrome, leucodopachrome, DHICA units in dopa-melanin is in contrast with the presence of carboxylic groups in melanin.

Cyclodopa (CDO ) or leucodopachrome was synthetized in 1968 and was found to be a very reactive substance, which is not converted under physiological conditions into DHI or DHICA in disagreement with Raper's scheme.The attention of the PCS should be addessed to the fact that in the same paper the Swiss researchers prepared crystalline derivatives of dopachrometo for the first time. ( H.Wyler, J.Chiovini, Helvetica Chimica Acta, 51, 1476-1494, 1968 ).The decarboxy derivative DCDO was not known until now.

b. The amount of O₂consumed and CO₂developed during melanogenesis do not correspond to the equations of the scheme. Evolved CO₂ originates from carboxyl of 2 and carbon atom 5 and 6 of ‘’indole ‘’.

c. Elemental analysis of the melanin do not correspond to the theoretical value of the proposed structure.

d. The DHI-melanin has one more oxygen and two fewer hydrogens per unit than the monomer,the polymer being (C₈H₅O3N)X rather (C₈H₃O₂N)X.

e. Quinones are powerful cytotoxic products unsuitable in a cellular environment.

f. The pigment of the cell is chemically and physically different from DHI-melanin and DHICA-melanin.